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          公司公告

          Molecular Ecology Resources | SSRSeq新方法實現多倍體準確基因分型、克服遺傳多樣性分析基礎難題

          發稿時間:2021-07-29來源:天昊生物



                  近日,南昌大學流域生態學研究所、天昊生物、中國科學院廬山植物園和復旦大學研究人員聯合在著名生態學期刊Molecular Ecology Resources發表了題為“High-throughput sequencing-based microsatellite genotyping for polyploids to resolve allele dosage uncertainty and improve analyses of genetic diversity,structure and differentiation: A case study of the hexaploid Camellia oleifera”的研究論文(Cui et al. 2021)。該研究以六倍體油茶為例,提出了SSRSeq新方法實現多倍體準確基因分型,克服了多倍體種群遺傳多樣性分析的基礎難題。


          英文題目:High-throughput sequencing-based  microsatellite genotyping  for polyploids to resolve allele dosage uncertainty and improve analyses of genetic diversity, structure and differentiation: A case study ofthe hexaploid Camellia oleifera

          中文題目:基于高通量測序的多倍體微衛星基因分型解決等位基因劑量的不確定性和改善遺傳多樣性、結構和分化的分析:以六倍體油茶為例

          期刊名:Molecular Ecology Resources

          發表時間:2021年7月14日

          影響因子:7.093 (一區 Top)

           

                  微進化就是等位基因頻率的變化。準確估計等位基因頻率是關鍵,是遺傳多樣性、遺傳結構和遺傳分化分析的基礎。常規的基因分型技術和群體遺傳學分析方法主要針對二倍體,可用分子標記對二倍體樣本準確基因分型,計算群體中的等位基因頻率,進而獲得可靠的種群遺傳多樣性、遺傳結構和遺傳分化分析結果。但是,針對多倍體的基因分型技術和群體遺傳學分析方法還不成熟。主要的挑戰是如何解決多倍體等位基因數量不確定(allele dosage uncertainty的難題(圖1)。

          圖1 常規方法難以對多倍體進行準確的基因分型,導致等位基因數量不確定(allele dosage uncertainty)。


                    多倍化在被子植物多樣化中起重要作用。約15%的被子植物物種形成事件伴隨著倍性增加,約35%的被子植物物種是多倍體(Wood et al. 2009)。由于多倍體常比二倍體近緣種長得更大、更快并具有更高產量,多倍化也可以促進作物的馴化和改良。許多重要作物是多倍體,如:四倍體土豆(Solanum tuberosum)、六倍體小麥(Triticum aestivum)和四倍體油菜(Brassica napus)。因此,對多倍體進行準確的基因分型和群體遺傳學分析,對于了解被子植物的演化、作物馴化和遺傳改良均具有重要意義。

                微衛星或簡單序列重復(SSRs)是群體遺傳學研究中最流行的分子標記之一。常規的微衛星基因分型技術無法準確鑒別多倍體的基因型,導致等位基因數量不確定。因此,在多倍體中,共顯性的微衛星基因型常不得不以類似顯性分子標記數據的處理方式進行分析,從而丟失了大量的等位基因及頻率信息。另一方面,類似GenoDive的少數軟件能處理等位基因數量不確定的微衛星基因型數據,可用最大似然法對等位基因的數量進行校正(假設種群內隨機交配)。由于實際的等位基因頻率未知,這類校正會使種群遺傳分化和遺傳結構分析產生偏差。

                有一些方法基于毛細管電泳中微衛星等位基因的峰面積比例來推測多倍體基因型。但是,毛細管電泳中微衛星等位基因的峰面積比例可能不反映實際的等位基因比例,特別是在沒有考慮微衛星等位基因的滑移峰(stutter peak)和擴增效率問題的情況下。微衛星的滑移峰會被誤判成等位基因峰,或與等位基因峰重疊使峰面積比例產生偏差;等位基因片段長度越長(微衛星重復次數越多),擴增效率往往越低,也會使峰面積比例產生偏差。這均會影響等位基因數量的準確估計。

                 Meirmans et al.(2018)通過模型模擬顯示,如果等位基因數量不確定,多倍體遺傳多樣性分析會產生明顯偏差:四倍體種群的觀測雜合度會遠高于真實值,而預期雜合度則略高于真值,并且無法進行哈迪-溫伯格平衡的檢驗。即使等位基因數量不確定,Stift et al.(2019)用模擬顯示仍可用STRUCTURE軟件對多倍體種群進行遺傳結構分析。缺少等位基因數量信息會高估多倍體種群的遺傳多樣性從而低估種群間的遺傳分化水平,模擬顯示經典的遺傳分化系數Fst可能難以反映多倍體種群間的遺傳分化(Meirmans & van Tienderen 2013; Meirmans et al. 2018)。亟需開發新的方法實現準確的多倍體基因分型,才能從根本上解決多倍體種群遺傳多樣性分析的基礎難題。本研究開發了新的基于高通量測序的微衛星基因分型方法(圖2),即SSRSeq技術,用于解決多倍體基因分型中等位基因數量不確定的難題。


          圖2 新的基于高通量測序的微衛星基因分型技術路線(修改自Cui et al. 2021)。SSRSeq count是Perl腳本把測序數據轉換成微衛星序列數量作為后續分析的輸入數據。SSRSeq V1.1軟件計算微衛星序列頻率分布,鑒別微衛星等位基因,進行滑移峰校正和擴增效率校正,獲得校正等位基因數量的微衛星基因型。

           

                 山茶屬(Camellia)中存在不少的多倍體,特別是在油茶組(Paracamellia)中。油茶(Camellia oleifera)是油茶組的模式物種,為常綠闊葉灌木或小喬木,主要是六倍體(圖3)。栽培油茶是我國第一大木本油料作物。油茶籽油富含單不飽和脂肪酸——油酸(高達80%以上),被譽為“東方橄欖油”,是優質健康的食用植物油。野生油茶(C. camellia)是栽培油茶育種寶貴的遺傳資源,廣泛分布于長江流域及其以南的亞熱帶常綠闊葉林中。了解野生油茶種群遺傳多樣性的空間分布格局是野生遺傳資源挖掘與利用的基礎。 

          圖3 油茶花和果實


                  Huang et al.(2018)用8個微衛星分子標記以常規毛細管電泳對廬山和井岡山野生油茶進行了基因分型。遺傳多樣性分析顯示觀測雜合度顯著大于預期雜合度;遺傳結構分析提示廬山和井岡山野生油茶間存在明顯的遺傳分化,每座山內不同海拔間的遺傳分化較小。然而,經典的遺傳分化系數Fst顯示,廬山和井岡山間的遺傳分化極低(Fst = 0.007),與每座山內的遺傳分化相等。該研究中野生油茶均為六倍體,常規基因分型導致的等位基因數量不確定會使等位基因頻率的估計產生明顯偏差,從而可能影響遺傳多樣性分析結果的可靠性。本研究采用新的基于高通量測序的微衛星基因分型的SSRSeq方法(圖2),用35個微衛星分子標記對六倍體野生油茶種群樣本進行了基因分型。結果顯示,微衛星的滑移比例(重復次數為n? 1的滑移序列頻率/重復次數為n的微衛星序列頻率)隨微衛星重復次數的增加而增加(圖4)。該研究開發了基于滑移比例的校正方法進行滑移峰校正,以獲得更為準確的微衛星基因分型結果。此外,微衛星擴增比例(觀測等位基因數量/預期等位基因數量)隨微衛星重復次數的增加有下降的趨勢(圖5)。該研究開發了基于擴增比例的校正方法進行擴增效率校正,以獲得更為準確的微衛星基因分型結果。該研究提供了SSRSeq V1.1軟件進行相應的校正,最后輸出校正等位基因數量的微衛星基因型。六倍體野生油茶種群樣本的研究結果顯示,校正的等位基因數量與預期的等位基因數量高度一致,說明新的方法可以獲得準確的多倍體基因型。


          圖4 微衛星滑移比例與重復次數的相關性(修改自Cui et al. 2021)。僅顯示微衛星分子標記Camellia_SSR_013在六倍體野生油茶樣本中的擴增測序結果(完整的結果詳見Cui et al.2021)。


          圖5 微衛星擴增比例與重復次數的相關性(修改自Cui et al. 2021)。僅顯示微衛星分子標記Camellia_SSR_013在六倍體野生油茶樣本中的擴增測序結果(完整的結果詳見Cui et al.2021)。


                  本研究比較了校正等位基因數量(等位基因數量確定)與未校正等位基因數量(等位基因數量不確定)的情況下,六倍體野生油茶種群遺傳多樣性、遺傳結構和遺傳分化分析的差異。該研究結果顯示,是否校正等位基因數量會對分析結果造成明顯影響。經過研究后發現,校正等位基因數量后,六倍體野生油茶種群的觀測雜合度(< 0.6)均顯著低于預期雜合度,近交系數為正;未校正等位基因數量,觀測雜合度均異常高(> 0.8),顯著高于預期雜合度,近交系數為負(圖6)。該結果與Meirmans et al.(2018)模型模擬結果類似,說明未校正等位基因數量會嚴重高估六倍體野生油茶種群的雜合度,尤其是觀測雜合度,導致偏離實際情況的統計推斷。野生油茶自交不親和,通過昆蟲傳粉異交,種子通過小型嚙齒動物在林下傳播,種群內基因擴散距離有限,因此種群的觀測雜合度應顯著低于預期雜合度,這與校正等位基因數量的結果一致。 


          圖6 六倍體野生油茶種群的觀測和預期雜合度(修改自Cui et al. 2021)。(a)校正等位基因數量;(b)未校正等位基因數量。


                  本研究發現,是否校正等位基因數量均可揭示六倍體野生油茶種群中明顯的遺傳結構,如:廬山野生油茶種群(LU)具有獨特的遺傳結構,與其他種群的遺傳分化最明顯(圖7和圖8)。廬山地處中亞熱帶與北亞熱帶交界區,位于野生油茶分布區北部,分布有耐低溫脅迫的野生油茶資源;廬山北臨長江、東南與鄱陽湖為鄰,與其他野生油茶種群分布地具有明顯的地理隔離。低溫等氣候條件的適應性隔離以及地理隔離可能共同造成廬山野生油茶種群獨特的遺傳結構。但是,校正等位基因數量可以揭示更為精細的種群遺傳結構(Cui et al. 2021),如:位于野生油茶分布區南部、地處南亞熱帶的羅浮山野生油茶種群(LF)此時顯示出明顯的遺傳分化(圖7和圖8)。 


          圖7 六倍體野生油茶種群樣本PCA分析結果(修改自Cui et al.2021)。(a)校正等位基因數量;(b)未校正等位基因數量。